老司机带你解锁ImageJ实用技巧（上）

ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）是美国National Institutes of Health（NIH）开发的基于Java的免费公共图像处理软件，在生物及医学图像分析中起着非常重要的作用。ImageJ软件学习最基本的参考书籍有ImageJ User Guide（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide.pdf）：

ImageJ软件学习中文参考书籍有孙水发、董方敏所著的《ImageJ图像处理与实践》：

除了上述的ImageJ参考书目外，各大论坛上也有诸多有关ImageJ软件使用的帖子，这些帖子通常涉及图像分析中的常见问题。我们所遇见的问题曾经也有人遇见过，通过论坛问答来学习ImageJ是一种学习的好方法，今天老司机使用论坛的问题来给大家分享ImageJ的使用。

下面为大家讲讲用ImageJ处理荧光共定位及Hoachest/PI双染观察细胞凋亡实验结果时常遇到的问题及解决方案：

问题一、请问怎么使用ImageJ把左边荧光分离的图转化为右面色谱峰图？

右图是左图中随着划线距离的荧光强度的变化，可由Plot Profile工具获得。

步骤：

ImageJ中使用直线工具或者矩形选框选择需要分析的直线或范围：

如下图所示点击Analyze→PlotProfile（快捷键Ctrl+K）即可得到随直线变化的荧光强度：

拓展：

Plot Profile也常用来表示荧光共定位（Colocalization）情况。那么什么是共定位？从物理角度来看，它意味着两种或多种颜色荧光分子发出的颜色占据图像中的相同像素。在生物学上，共定位是指两个或多个不同分子位于细胞中的同一结构（部位），如下图所示：

问题二、两张荧光图片用ImageJ 软件Merge之后荧光消失了，求解答？

我在做Hoachest/PI双染观察细胞凋亡拍出来的图片，用ImageJ软件Merge了一下，但是原来图片上的亮蓝色细胞merge后就暗下来了，很奇怪有人能帮忙解答一下么，挺急的。感谢感谢。

荧光图片拍摄过程中需要防止过度曝光。Hoachest染的细胞核存在过曝，与PI阳性的细胞进行Merge后会显得红色很弱。如何判断拍摄荧光图片是否过曝？

步骤：

ImageJ软件Plot Profile工具可以判断是否过曝。打开Hoachest所染的细胞核：

使用直线工具在细胞核上划线，使用Plot Profile工具得到随直线变化的细胞核荧光强度改变：

可见在50-90pixels范围内细胞核荧光强度为平台，都达到了255，此处即为过曝。过曝的显著特点是出现荧光强度无变化的平台期：

过曝有什么危害？为什么荧光图片不能过曝？

简言之，50-90pixels内可能本身存在荧光强度的变化，例如在230-250之间变化。当过曝时无论是230还是250都变为了255，这样就失去了比较荧光强度的意义了。如何在共聚焦图片拍摄过程中判断荧光图片有无过曝？

蔡司共聚焦Zen2009软件也可在拍摄图像后在Profile下划线来判断图像是否过曝：

当然提问中的图片只涉及PI阳性细胞的比例，不涉及荧光强度的比较，过曝并不影响分析，但会影响图片的美观程度。

回到问题，提问者觉得PI红色荧光弱，导致图片不好看，我们可以适当的在Image→ Adjust→ Braightness/ Contrast下调整对比度与亮度，然后亮蓝色细胞就可以显现出来了：

好了，今天就给大家解答到这里。下次为大家推出如何使用imageJ软件分析免疫印迹（Western Blot）的实验结果、小球计数、计算叶片面积及其使用过程中可能会遇到的问题和解决方案。

推荐阅读：

基金申请、答疑解惑、科研资源互助群

务必备注：入群学习

务必备注：入群学习

务必备注：入群学习

从以下20个热点入手，每天给大家分享干货：

1	miRNA非经典机制	11	肠道菌群
2	lncRNA的10种机制	12	细胞自噬
3	circRNA	13	细胞焦亡、铁死亡
4	单细胞测序	14	间充质干细胞
5	转录因子	15	肿瘤干细胞
6	可变剪接	16	外泌体
7	SNP	17	氧化应激
8	泛素化修饰	18	调节性T细胞
9	组蛋白修饰	19	RNA甲基化修饰
10	蛋白激酶和磷酸酶	20	肿瘤微环境

而这些研究方向参与疾病发生发展过程的分子机制，可以归纳总结为一下几类研究：

①分子（DNA、RNA、蛋白质、小分子）的表观遗传修饰；

②分子拷贝数的表达变化差异；

③RNA分子的剪接加工、出核、细胞组织水平的时空变化研究；

④特殊的一群细胞类型研究、细胞通讯微环境研究；

⑤具有临床应用潜力的新技术（CRIPSR）或者载体（膜结构、细胞等）；

⑥关注细胞生理学现象：自噬、凋亡、线粒体失功等；

长按二维码识别关注“小张聊科研”

关注后获取《科研修炼手册》1、2、3、4、5、6、7、8、9